2023 年 1 月 25 日发布

传统上，VERO 细胞在 Dulbecco 改良 Eagles 培养基 (DMEM) 或含有 10% 胎牛血清 (FBS) (EMEM-10% FBS），并已成功生产出多种病毒类型，用于在商业上可行的水平上生产疫苗 [2] [3] [4]。然而，由于胎牛血清中存在潜在外来因子的安全性问题、可重复性差以及供应有限，监管机构的指导表明在疫苗生产中应采用牛血清的替代品 [5] [6]。

VERO 细胞可以很容易地适应无血清条件，前提是更换关键的血清蛋白成分以支持这些细胞成功增殖所依赖的必要生物学功能。 OptiVERO® 是一种化学成分确定的培养基，含有 VERO 生长所需的重组血清蛋白，已证明在扩增 VERO 细胞和d 随后在烧瓶和微载体培养中产生病毒 [7]。因此，这种无血清培养基代表了病毒生产的进步，因为 VERO 细胞可以在没有定义不明确的含血清培养基的情况下扩增。

另一项进步已迅速被用作临床的主要主力病毒载体和疫苗制造是颇尔 iCELLis® 生物反应器。作为一次性固定床生物反应器，iCELLis® 技术的核心是独特的紧凑型微纤维，构成固定床并提供较大的生长表面积，以提高传统搅拌釜反应器的体积生产率。凭借其动态环境和全自动 PID 控制系统，从种子培养到最终产品的整个细胞培养过程得到简化，并且很容易适应从研发到临床制造的过程。

在这里，新型 OptiVERO® 化学成分确定的培养基是结合 iCELLis® 平台来确定疗效这两项对病毒疫苗制造的创新。总的来说，所提供的数据证明了 FBS 可以被称为 OptiVERO® 的化学成分确定的无血病毒生产培养基所替代，该培养基成功地证明了与 iCELLis® 生物反应器中含血清培养基相当的扩增，因此适用于临床应用.

用于细胞增殖实验的VERO细胞最初是从ATCC (CCL-81; Manassas, VA)获得的。 VERO 细胞在加湿培养箱中于 37⁰C/5% CO2 条件下在烧瓶（Corning，Corning，NY）中常规培养，并每 3-5 天传代一次。

完整的 OptiVERO® 培养基是通过解冻冷冻的培养基制备的蛋白质和培养基补充剂，并在无菌条件下直接添加到基础培养基中。 EMEM (MediaTech, Manassas, VA) 辅以 FBS (ATCC Manassas, VA) 作为传统的含 FBS 培养基对照用于细胞扩增。培养基补充有抗生素以2D 培养瓶扩增的最终 0.1 倍和 iCELLis® 中扩增的最终 1 倍。

维持在 EMEM-10% FBS 中的早期传代 VERO 细胞用 DPBS 广泛洗涤以去除所有痕迹的血清，随后使用含有 1 mM EDTA 的 0.05 mL/cm2 TrypLE 从生长表面去除。加入等体积的 0.25% 大豆胰蛋白酶，加入 0.2 mL/cm2 DPBS 收集细胞。将细胞以 1000 RPM 离心 5 分钟，然后重悬于最小体积的预热 OptiVERO® 中。将细胞以 20,000 个细胞/cm2 的初始细胞密度接种在含有预热 EMEM-10% FBS 或 OptiVERO® SFM 的 T-75 烧瓶中。 VERO 细胞每 3-5 天进行一次传代培养，随后进行扩增，直至培养瓶达到推荐的 15,000 至 20,000 个细胞/cm2 的 iCELLis® 生物反应器接种密度。

一个在播种前一天，组装了 iCELLis® 纳米生物反应器pH 和溶解氧 (DO) 探头根据 Pall 的说明进行了校准。生物反应器和配套组件在高压灭菌器中灭菌并冷却。通过分别向生物反应器中添加 650 mL 冷的完全 OptiVERO® SFM 或 EMEM-10% FBS 来完成培养基的初始分批和平衡。生物反应器以 95% 的 DO 设定点、2 cm/s 的线性进料速率、7.25 的 pH 设定点和 37°C 的温度设定点运行至少 4 小时至最多 12 小时。在接种当天，收获烧瓶并进行细胞计数以确定在 iCELLis® 中达到 15,000 至 20,000 个细胞/cm2 所需的接种量。通过将计算出的所需体积的细胞悬浮液加载到转移组件中并泵入生物反应器来接种细胞。然后将生物反应器达到最终 0.18 mL/cm2 工作体积所需的剩余介质体积泵送通过转移组件以追踪细胞接种物。设定点温度和 pH 值分别保持在 37°C 和 7.25。 OptiVERO® 的线性进料速率设置为 2 cm/s，EMEM-10% FBS 的线性进料速率设置为 1 cm/s。 OptiVERO® 的 DO 设置为 95%，EMEM-10% FBS 的 DO 设置为 50%。每天对生物反应器进行采样以检测葡萄糖消耗、乳酸生成、离线 pH 分析和离线细胞核计数以监测培养进度。如果需要，再循环回路在生物反应器种子后 24 小时激活。 VERO 细胞在 iCELLis® 生物反应器中最多可生长 5 天，然后终止运行并采集最终样本。

VERO 细胞在 iCELLis® 纳米生物反应器中扩增 5 天EMEM-10% FBS 培养基和 OptiVERO® SFM 用于确定 OptiVERO® 在适合临床应用的大规模平台上执行的能力。每天进行采样以收集离线细胞核计数并计算群体倍增 (PDL)。如图所示，计算了两次独立运行过程中的累积 PDL 并取平均值在图 1 中，EMEM-10% FBS 和 OptiVERO® 的总 PDL 相当，分别为 3.32 ± 0.87 和 3.17 ± 0.04。在两种培养基条件下，T-75 烧瓶对照观察到类似的扩展趋势，EMEM-10% FBS 中的总 PDL 为 3.47 ± 0.69，OptiVERO® 中的总 PDL 为 3.42 ± 0.44。

OptiVERO 还在 iCELLis 中展示了与 EMEM-10% FBS 相当的生长动力学，计算出的平均倍增时间为 27.88 ± 7.56小时，而 EMEM-10% FBS 显示为 34.01 ± 2.24 小时。最大细胞密度经计算在 EMEM-10% FBS 中为 1.63e5 ± 0.94e5 核/cm2，在 OptiVERO® 中为 1.24e5 ± 0.19e5 核/cm2 .

iCELLis® 中两种培养基条件下的代谢物概况是通过每天对每种培养基进行葡萄糖和乳酸浓度采样来监测的。如下图 2 所示，趋势与细胞生长相关，连续在两个生物反应器中扩展的 5 天内葡萄糖的消耗和乳酸的产生EMEM-10% FBS 和 OptiVERO® 设置。同样，在整个运行期间，EMEM-10% FBS 和 OptiVERO® 每天离线采样 pH 值并保持在设定值 7.25 以上。

为了进一步证明 OptiVERO® 在 iCELLis® 生物反应器中的相容性，对不同大小的生长表面积进行了测试，范围从最小的可用纳米表面积 0.53 平方米到 2.6 平方米的生长表面积.为了使结果标准化，计算了每 cm2 的细胞核，结果总结如下表 1 所示。

表 1. 3 次独立运行的结果总结，以在不同条件下在 OptiVERO SFM 中扩增 VERO 细胞iCELLis 生物反应器的大小。

在 0.53 平方米生物反应器中接种 5 天后，表面积大小组合中的平均细胞核数/平方厘米为 9.89e4 ± 0.42e4，在 2.6 平方米生物反应器中为 1.38e5 ± 0.13e5或者，在 0.53 m2 生物反应器中为 1.11e5 ± 0.08e5。还计算了倍增时间，第 1、2 和 3 轮的细胞生长动力学分别确定为 39.96 ± 9.60 小时、25.93 ± 9.91 小时和 31.35 ± 4.09 小时。

在此处演示新型化学定义的 OptiVERO® 可以支持 iCELLis® 生物反应器平台中的 VERO 细胞快速增殖，而无需补充血清。 VERO 细胞在 OptiVERO® 中在 iCELLis® 中扩增 5 天，表现出与使用 EMEM-10% FBS 培养基观察到的累积群体倍增、最大细胞密度和倍增时间相当。同样，葡萄糖消耗与乳酸生成之间的相关性表明两种培养基条件下细胞生长强劲。随着疫苗已成为针对严重传染病和其他严重疾病提供保护的革命性工具，对安全、可靠和高效的生物制造平台的需求已成为一切更明显的是，将监管指南从血清指南中推开。此外，由于成分的变化以及供应的可靠性，FBS 具有许多缺乏重现性的相关风险 [6]。因此，OptiVERO® 提供了一种有吸引力的解决方案来规避这些定义不明确的血清和血清衍生成分，同时仍提供疫苗生产所需的高性能。

同样重要的是用于制造病毒疫苗的平台提供整个系统的稳健性、效率和整体生产力。搅拌罐生物反应器和微载体培养等传统技术体积生产率低、运营成本高，而且工艺影响具有挑战性。创新的 Pall iCELLis® 生物反应器通过提供简化的固定床超细纤维系统克服了许多这些制造障碍，从而提高体积生产率、更好的过程控制和更容易适应从研发到临床制造的能力。

OptiVERO® 化学成分确定的培养基和 iCELLis® 生物反应器这两项进步相结合，协同工作，为病毒载体生产提供高效的解决方案。此处介绍的这些研究展示了用化学成分确定的无血清培养基替代 FBS 的能力，以实现稳健的 3D VERO 扩增，最终产生成功制造当今正在开发的疫苗所需的高病毒滴度。

有关其他产品或技术信息，请联系我们：2718 Industrial Drive

Junction City, KS 66441电话：1.800.916.8311

电子邮件：Info@InVitria.com在此处查看 PDF 脚注R。 Hegde，\"基于细胞培养的流感疫苗：对未来必不可少的投资”，Hum。疫苗 Immunother.，第一卷。 11，没有。 5，第 1223–1234 页，2015.N。 Barrett、W. Mundt、O. Kistner 和 M. K. Howard，\"疫苗生产中的 Vero 细胞平台：转向细胞培养基地d 病毒疫苗”，Expert Rev. Vaccines，vol。 8，没有。 5，第 607–618 页，2009 年 5 月。Desmyter、J. L. Melnick 和 W. E. Rawls，\"非洲绿猴肾细胞系 (Vero) 中干扰素生产和风疹病毒干扰的缺陷”，病毒学杂志，卷. 2，没有。 10，第 955–961 页，1968 年 10 月。 Govorkova、S. Kodihalli、I. V. Alymova、B. Fanget 和 R. G. Webster，\"在 Vero 或 MDCK 细胞和含胚鸡蛋中培养的流感病毒的生长和免疫原性”，Dev。生物学。站立，卷。 98，第 39-51 页； discussion 73-74, 1999.\"关于通过人用和兽药产品传播动物海绵状脑病药物的风险最小化的指导说明 (EMA/410/01 rev.3)”，第 3 页。 18.van der Valk 等人，\"胎牛血清 (FBS)：过去 – 现在 – 未来”，ALTEX，卷。 35，没有。 1，第 99–118 页，2018 年。Alfano、A. Pennybaker、A. Cunningham、P. Halfmann 和 C. Huang，\"无血和化学成分确定的病毒生产的配方和生产VERO 细胞培养基”，2019。开始新搜索快速搜索链接应用：

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