无血清条件下的慢病毒生产方案 - 如何提高转染效率和滴度产量

来自 : 发布时间：2024-05-06

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2021 年 8 月 28 日发布

Sofia Pezoa，博士，细胞培养科学家，InVitria

在无血清、化学定义的条件下生产慢病毒

简介

基于病毒载体的基因疗法是治疗中有前途的候选者由于病毒具有将遗传内容转移到靶细胞中的天然能力，因此导致罕见的遗传疾病。由于病毒的低免疫原性、整合到基因组中的能力以及慢病毒的产生和处理的相对安全性，慢病毒 (LV) 是一种有利的基因传递机制。然而，传统的生产方法在贴壁细胞慢病毒生产中依赖于胎牛血清的使用，提高了对f的要求。或无动物和无血系统，以克服批次间的不一致性、外来因子污染的可能性以及血清供应链中可能存在的限制。1因此，我们开发了一种使用粘附的 HEK-293T 生产慢病毒的方法使用 OptiPEAK® HEK293t，一种化学成分确定的无血清和无血培养基。

背景

慢病毒属于逆转录病毒类，它们是有包膜的、基于 RNA 的病毒。虽然 LV 源自人类免疫缺陷病毒 (HIV)，但 LV 是假型的，因此 LV 载体缺乏形成 HIV 颗粒所需的基因。此外，生成更安全的 LV 载体和更安全的处理程序的策略已经产生了第二代和第三代载体，将形成 LV 载体所需的基因分成三个或四个质粒，这些质粒被转染到包装细胞中。最后，LV 载体无法复制并且通常会自我失活，导致病毒颗粒无法复制在传递他们的遗传内容后，他们自己在细胞内。 LV 技术的这些进步已经产生了可以感染多种细胞的安全高效的载体。

LV 载体用于治疗罕见遗传病或癌症的临床应用已经取得了令人鼓舞的结果。2虽然 3 期临床试验尚未完成，但仍需要大规模生产 LV 载体以满足预期获批产品的商业需求。

使用贴壁细胞生产 LV 的传统方法依赖于在用于包装 LV 载体的细胞的生长和生产阶段使用胎牛血清 (FBS)。 FBS 提供生长因子和细胞因子的来源，以及抗氧化能力；然而，大规模制造中的 FBS 存在许多限制，包括但不限于成本、批次间差异以及 FBS 供应链中断。此外，FBS 还提高了可能性 of 引入可能影响 LV 临床疗效的生物外来因子或污染物质。因此，需要可大规模商业化的无血清培养基。然而，从历史上看，消除贴壁 HEK-293T 细胞的血清和血液来源的蛋白质在生产、可扩展性和所产生病毒的稳定性方面存在问题。因此，我们开发了一种无血清、无血和化学成分确定的培养基，用于在商业规模生产中使用贴壁 HEK-293T 细胞生成高滴度（>1 x 107 滴度单位/mL）LV 载体。

材料与方法

细胞系和试剂

HEK-293T（HEK-293T；ATCC CRL-3216）和 HT-1080（ATCC CCL-121）保存在 DMEM + 10% FBS 中用于血清条件或完整的 OptiPEAK HEK293t (InVitria) 用于无血清条件（称为 OptiPEAK HEK）。血清培养细胞在标准条件下（5% CO2，37 °C）生长，而 OptiPEAK HEK 培养细胞在 10% CO2 和 37 °C 下生长。通过从 FBS 传代细胞直接适应，使细胞适应无血清条件。两种细胞类型都通过每 3-4 天用 TrypLE (Thermo Fisher Scientific #A1217701) 传代来维持，并以 10,000 个细胞/cm2 的初始密度接种。 HEK-293T 细胞经过三代适应无血清条件。先前已经研究和记录了接种和转染的最佳细胞密度。3

转染和试剂

第二代 LV 载体是在二维贴壁条件下使用装有 HEK-293T 细胞的 T-75 培养瓶制备的。对于转染，HEK-293T 细胞在转染前一天以 75,000 个细胞/cm2 的密度接种。

两种条件下用于转染的质粒 DNA 的优化量确定为 0.16 µg/cm2 或每个 T-75 烧瓶 12 µg。使用的第二代 LV 质粒是 psPAX2（Addgene #12260）、pMD2.G（Addgene #12259）和 pSIH1-H1-siLuc-copGFP 转移质粒（Syste米生物科学）。我们选择了 3 µg 转移质粒、2 µg VSV-g 和 1 µg Gag-Pol 的优化比例，据报道，与其他比例相比，这种比例可产生高效价的 LV 载体。4

对于无血清和含血清条件，转染试剂 PEIpro (Polyplus) 的质粒 DNA 与 PEI 比例为 1:1。对于络合，PEI 和质粒 DNA 首先分别稀释 40 倍，然后在用于无血清的完整 OptiPEAK HEK 或用于血清条件的 Opti-MEM™（Gibco，Thermo Fisher Scientific）中轻轻混合。然后将稀释的质粒 DNA 添加到稀释的 PEI 中，并通过轻轻移液或旋转混合。复合物在室温下形成 15 分钟，随后用适当的培养基进一步稀释至 0.08 mL/cm2 的最终量，并在条件培养基从烧瓶中吸出后通过完全更换培养基添加到细胞中。

细胞在描述的生长条件下转染两个小时，反式通过完全更换培养基去除感染复合物，并将完全生长培养基以等于 0.13 mL/cm2 的量添加回烧瓶中。转染后的细胞在不更换培养基的情况下生长 48 小时，从烧瓶中收集总上清液并短暂离心以清除细胞碎片，然后立即用于功能测试。

在所有步骤中都应小心

功能滴定

如前所述进行 LV 颗粒的功能滴定。5 HT-1080 细胞以每孔 30,000 个细胞的密度接种在 12 孔板中并被允许粘附在组织培养塑料上至少两个小时。附着后，完全生长培养基被转导培养基取代，转导培养基由 DMEM + 10% FBS 和 10 µg/mL Polybrene (Millipore Sigma TR-1003-G) 和 0.1% F-68 (Thermo Fisher Scientific #24040032) 组成。

LV 上清液在感染培养基中连续稀释，然后然后将 5 µL 稀释的 LV 添加到细胞中。将细胞孵育 48-72 小时，然后收获细胞用于通过流式细胞术 (BD Accuri C6 plus，BD) 进行荧光分析。功能效价通过以下计算确定：

功能滴度计算结果和结论

在 OptiPEAK 中培养的 HEK-293T 细胞与 DMEM + 10% FBS 相比，HEK 无血清培养基的倍增时间平均提高 18.3%（OptiPEAK HEK 为 24.35 ± 2.54 小时，完全 DMEM 为 29.81 ± 4.74 小时）。转染后 27 小时 HEK-293T 细胞的形态学比较也显示 OptiPEAK HEK 与血清具有相同的特征（图 1）。

图 1. 转染后 27 小时 HEK-293T 在血清和无血清培养基中的形态特征。HEK 明场图像-293T 单层细胞在用 LV 质粒转染后 27 小时。(A) HEK-293T 细胞在 DMEM + 10% FBS 中生长。(B) HEK-293T 细胞在无血清 OptiPEAK HEK 培养基中生长。

培养的 HEK-293T 细胞在 OptiPEAK 中，HEK 以均匀的单层生长，并且与 DMEM + 10% FBS 相比表现出相同的形态变化，因为 HEK-293T 细胞开始产生病毒颗粒（图 1，B）。这些结果表明，血清和血液中的转染和病毒产生-free OptiPEAK HEK 与血清条件等效。

通过 HT-1080 转导测定法分析功能滴度产生与形态学特征和生长动力学相似的结果。通过流式细胞术测定含血清和血清-自由条件表现出相同的性能（图 2）。平均DMEM + 10% FBS 的功能滴度为 1.79 ± 1.03 x 107 TU/mL，OptiPEAK HEK 的平均滴度为 2.33 ± 1.91 x 107 TU/mL，处于 DMEM + FBS 的标准偏差范围内（图 2）。数据显示，与存在 10% FBS 的 HEK-293T 细胞相比，贴壁 HEK-293T 细胞在无血清和无血条件下的 2D LV 生产性能相当。

图 2. 含血清和无血清条件下的功能性 LV 滴度。通过 HT-1080 转导测定法测定在 DMEM + 10% FBS 或无血清 OptiPEAK HEK 中生长的 HEK-293T 细胞的总 LV 上清液的功能滴度单位 (TU)。误差条显示标准偏差，总共三个独立实验，每个实验重复两次。

LV 的临床应用需要 >1 x 的功能滴度每位患者 109 个感染单位，只有在通过阴离子交换层析或切向流过滤进行纯化和浓缩后才能实现大规模 LV 生产。 6 上述数据显示了使用无血清和无血方法进行 LV 生产的结果HEK-293T 细胞。这种方法可以使用贴壁生物反应器（例如 iCELLis® 生物反应器（颇尔公司））进行放大，并克服 FBS 供应链和批次间不一致的限制。

固定床生物反应器正在铺平道路用于大规模贴壁病毒载体生产，克服贴壁细胞培养可扩展性方面面临的挑战。 6 在大规模制造中消除血清和血液来源的蛋白质将克服经常困扰这些制造形式的许多障碍，例如发泡通常用血清观察。此外，虽然悬浮培养也被用于用 HEK 细胞生产 LV，但它在据报道，生产批量小于 3 L。

我们已经展示了一种在无血清培养基中使用贴壁 HEK-293T 细胞生产 LV 的方法，该方法可以扩大到生产生物反应器理论总产量 >1 x 109 TU/mL，满足临床需求，不受血清包含的限制和不一致。

在此处查看 PDF 脚注 Raturi、M 和 Andy Kusum。\"Covid-19 爆发期间的血液供应管理”。 Transfus Clin Biol 27 (2020).Milone, M. C. 和 U. O’Doherty (2018)。 \"慢病毒载体的临床应用。”白血病 32(7)：1529-1541.Alfano, R., S. Pezoa, A. Pennybaker 和 N. Hazi。 \"应用 Aber 生物质探针在基于化学定义的 iCELLis® 生物反应器的病毒载体制造中告知转染时间”，（2021 年），海报，invitria.com.Bajpai，R.（2011 年）。 \"慢病毒介导的多能干细胞修饰”，载于人类多能干细胞：方法和方案、方法分子生物学，由 P. H. Schwartz 和 R. L. Wesselschmidt 编辑，Springer Science + Business Media, LLC。 767: 315-331.Sena-Esteves, M. 和 G. Gao (2018)。 \"慢病毒载体的滴定。” Cold Spring Harb Protoc 2018(4).McCarron, A.、M. Donnelley 和 D. Parsons (2017)。 \"用于基因治疗的慢病毒载体的放大：进展和挑战。”细胞和基因治疗见解 3(9)：719-729。开始新搜索快速搜索链接应用：

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